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  • 类似技术
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  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1986000989A1
    申请号:PCT/DE1985/000253
    申请日:1985-07-25
    公开日:1986-02-13
    发明作者:Jürgen SCHUMACHER；Detlev Riesner
    申请人:Schumacher Juergen；Detlev Riesner；
    IPC主号:G01N27-00
    专利说明:
    [0001] Elektrophoretisches Verfahren zur Trennung von Biopolymeren
    [0002] Bei der Erfindung handelt es sich um ein elektrophoretisches Verfahren, bei dem elektrisch geladene Biopolymere aufgrund ihrer unter verschiedenen Be dingungen vorliegenden unterschiedlichen makromolekularen Strukturen auf getrennt werden.
    [0003] Gelelektrophoretische Trennungen werden nicht nur in vielfältiger Weise zu rein wissenschaftlichem Fragestellung eingesetzt, sondern es besteht auch ein großer Bedarf im Bereich z.B. der Medizin, Phytopathologie und Gentech nologie. Eine Reihe von Krankheiten sind mit dem Auftreten wohl definierter Nukleinsäuremoleküie verbunden, die jedoch nur schwierig von den unzähligen Nukleinsäuren des gesunden Organismus zu trennen sind. Auch auf dem Gebiet der Proteine gehen sehr oft pathogene Veränderungen mit Änderungen im Elektrophoresemuster der Moleküle einher. Zu einer sicheren Diagnose und zur Gewinnung hochreiner Therapeutika ist eine vollständige Abtrennung der krankheitsspezifischen Nukleinsäuren bzw. Proteine unerläßlich. Das Problem der Analyse trat u.a. in den letzten Jahren besonders deutlich bei sogenannten Viroidinfektionen auf. Viroide sind subvirale Erreger mehrerer wirtschaftlich schwerwiegender Pflanzenkrankheiten, die allein aus einer Nukleinsäure vom Molekulargewicht 100.00120.000 bestehen und nicht die für Viren charakteristische Hülle besitzen. Auf den Philippinen sterben jährlich 300.000-500.000 Kokospalmen infolge einer Viroidinfektion ab. In Europa und Amerika sind besonders Gewächshauskulturen und Kartoffel saatgut betroffen. In der Vergangenheit hat sich gezeigt, daß bei keinem anderen Verfahren in der Biochemie eine solche Vielzahl von Molekülen so reproduzierbar aufgetrennt werden kann wie in der Elektrophorese. Aus diesem Grund wurde und wird sie hauptsächlich bei analytischen Fragestellungen eingesetzt. Aber auch in präparativem Maßstab ist die Elektrophorese kaum zu ersetzen. Besonders gute Trennleistungen werden mit der zweidimensionalen Gelelektrophorese erzielt. Bei dieser Technik werden die Proben zunächst einer normalen Elektrophorese unterworfen. Danach wird der Gelstreifen, der die aufgetrennten Moleküle enthält, ausgeschnitten, um 90° gedreht für die 2. Dimension erneut einpolymerisiert, und die Proben werden unter anderen Bedingungen elektrophoretisch weiter aufgetrennt.
    [0004] Man macht sich dabei zunutze, daß Biopolymere z.B. bei verschiedenen Temperaturen unterschiedliche molekulare Strukturen und somit unterschiedliche elektrophoretische Mobilität zeigen. Dadurch gelingt es, Moleküle, die bei einer bestimmten Temperatur im elektrischen Feld exakt gleiches Laufverhalten zeigen, bei einer anderen Temperatur zu trennen. Besonders ausgeprägt ist dieses Verhalten bei ringförmigen Nukleinsäuren, zu denen die oben erwähnten Viroide gehören. So fallen bei entsprechender Wahl der Bedingungen z.B. zirkuläre RNAs- deutlich aus der Front der übrigen Nukleinsäuren heraus. Allerdings kann mit dieser Technik pro Gel immer nur eine Probe aufgetrennt werden. Aus diesem. Grund wurde eine modifizierte zweidimensionale Gelelektrophorese, die bidirektonale Gelelektrophorese, eingeführt, mit Hilfe derer pro Gel mehrere Proben untersucht, verglichen und quantifiziert werden können (Schumacher et al., (1983) Anal. Biochem. 135, 288-295). Speziell der Viroidnachweistest wird mittlerweile in den verschiedensten wissenschaftlichen Laboratorien mit großem Erfolg angewendet.
    [0005] Alle diese Methoden haben aber den großen Nachteil, daß für die zweite Dimension ein Gelstreifen, der die in der ersten Dimension aufgetrennten Proben enthält, ausgeschnitten und erneut einpolymerisiert werden muß. Zudem erfolgt die Homogenisation der Gewebeproben mit Geräten, die nach jedem Aufschluß zur Vermeidung von Kontaminationen sorgfältigst gereinigt werden müssen. Auch der Einsatz von organischen Lösungsmitteln wie Phenol und/oder Chloroform kann für wissensciiaftl iche Aufgabenstel lungen. zwar akzeptiert werden, macht diese Verfahren für den Routineeinsatz aber unbrauchbar. So haben sich bisher z.B. in Saatzuchtbetrieben und staatlichen Untersuchungsanstalten viel teurere Methoden, die mit Radioaktivität oder schwer erhältlichen Antikörpern arbeiten, durchgesetzt. Bei der vorgestellten Erfindung handelt es sich um ein gelelektrophoretisches Verfahren, das die bisher unumgänglich erscheinenden oben beschriebenen Nachteile ausschaltet. Es gelang dabei, die zweidimensionale Auftrennung in ein und derselben Gelmatrix durchzuführen, d.h. auf das komplizierte Ausschneiden und Elnpolymerisieren des Gelstreifens zu verzichten. Die Biopolymere, z.B. die Viroide, werden zunächst bei Raumtemperatür in einer Richtung elektrophoretisch aufgetrennt. Durch Einfüllen fast kochenden Puffers erfahren die Nukleinsäuren eine Strukturänderung, die Elektrophoreserichtung wird umgekehrt, und die Viroid RNAs können von den übrigen Nukleinsäuren sowohl in analytischem als auch präparativem Maßstab getrennt werden.
    [0006] Folgendes Beispiel verdeutlicht das Verfahren. Die zu untersuchenden Gewebeextrakte werden in einem 5% Polyacrylamid-Gel in Gegenwart von 89 mM Tris-Borat und 2,5 mM EDTA bei Raumtemperatur in einer handelsüblichen Gelelektrophorese-Apparatur, die in Figur 1 dargestellt ist, zusammen mit dem Farbstoff Xylen-Cyanol FF aufgetrennt. Hierzu werden die Proben in die Geltaschen (1) eingefüllt und solange einer Elektrophorese unterworfen, wobei die Nukleinsäuren zum (+)Pol hin wandern, bis Xylen-Cyanol den unteren Rand der Gelmatrix erreicht hat (Fig. 1a). Unter den beschriebenen Bedingungen läuft dieser Farbstoff, exakt mit der Viroid RNA. Danach wird der Elektrophorese-Puffer durch heißen Puffer ersetzt, der 10 mM Tris-Borat und 0,3 mM EDTA enthält und die noch im Gel verbliebenen Nukleinsäure durch Umpolen der Spannung in entgegengesetzter Richtung in derselben Matrix wiederum der Elektrophorese unterworfen (Fig. 1b). Aufgrund der unter dieser Bedingung vorliegenden Struktur läuft die Viroid RNA deutlich langsamer als die übrigen noch in der Probe vorhandenen Nukleinsäuren. Die Elektrophorese wird abgestoppt, wenn der Farbstoff Xylen-Cyanol etwa 2/3 der Gelmatrix durchwandert hat. Nach Färbung des Gels mit Silber-Nitrat wird ein Bild erhalten wie es beispielhaft in Fig. 2 dargestellt ist. Deutlich ist in Proben aus infiziertem Gewebe die durch den Pfeil markierte herausfallende ViroidBande zu erkennnen (Bahnen 1,3,4). Die Bahnen 2 und 5 enthalten Nukleinsäureextrakt aus gesundem Gewebe. In Bahn 6 befindet sich als Referenz reine Viroid RNA. Diese Nachweismethode ist so empfindlich, daß noch 80 pg Viroid RNA, das entspricht 0,1% des Viroidgehaltes, der bei einerstarken Infektion im Gewebe gefunden wird, nachgewiesen werden können. Diese hohe Nachweisempfindlichkeit ermσgicht den totalen Verzicht auf radioaktiv markierte Hybridisierungsproben. Dadurch kann auf viele Sicherheits Vorkehrungen verzichtet werden, die eine Routinediagnostik erschweren. Die Trennleistung der vorgestellten Methode ermöglichte es, eine sehr einfache und daher zur Routine geeignete Probenvorbereitung zu entwickeln. Es kann z.B. direkt vom Preßsafl aus Blättern oder Wurzeln ausgegangen werden, aus dem nach Zusatz, von Diethylpyrocarbonat die Nukleinsäure gefällt wirddie entsprechenden Pressen sind weit verbreitet und für den Routinebetrieb ausgelegt. Es wurde auch gefunden, daß alternativ das entsprechende Pflanzengewebe mit Puffer, der Diethylpyrocarbonat enthält, in Einmalgefäßen wie kleinen Plastikröhrchen mit Glasperlen homogenisiert werden kann. Ein Schockfrieren des Gewebes in flüssiger Luft oder flüssigem Stickstoff vor dieser Homo enisation erhöht die Ausbeute an nukleinsaure, ist aber nicht unbedingt notwendig. Nach der Fällung der Nukleinsäure mit Ethanol kann das Präzipitat unmittejbar elektrophoretisch aufgetrennt werden. Der wesentliche Vorteil gegenüber allen früher versuchten Methoden liegt somit darin, daß vollkommen auf gesundheitsschädliche organische Extraktionsmittel wie Phenol, Chloroform und Ether und damit ebenfalls wie bei der Radioaktivität auf besondere Sicherheitsmaßnahmen verzichtet werden kann. Eine große Zeitersparnis wurde dadurch erreicht, daß kein mechanisches Zerkleinerungsgerät, das, um ein Verschleppen der Infektionsträger zu vermeiden, nach jeder Probe sorgfältig gereinigt werden muß, angewendet wird. Die Zeitdauer für den gesamten Test beläuft sich vom Ernten des Pflanzenmaterials bis zum fertigen Gel auf weniger als 7 Stunden. Die reine Arbeitszeit beträgt weniger als eine Stunde.
    [0007] Der vorgestellte Test eignet sich damit aufgrund seiner Schnelligkeit, Einfachheit, hohen Nachweisempfindlichkeit und durch den vollkommenen Verzicht auf Radioaktivität und somit seiner Sicherheit zum Routineeinsatz bei Reihenuntersuchungen.
    [0008] Dieses hier für Viroide beschriebene Verfahren kann mit leichten Modifikationen für sehr viele andere Nukleinsäuren und geeignete Proteine oder andere Biomoleküle angewendet werden.
    权利要求:
    ClaimsPATENTANSPRÜCHE
    1. Elektrophoretisches Verfatircn zur Trennung von elektrisch geladenen Biopolymeren unter Ausnutzung ihrer Strukturumwandlungen, bei dem zeitlich aufeinanderfolgend zwei Trennungen durchgeführt werden, von denen die eine unter strukturstabilisicrenden, die andere unter strukturdestabilisierenden Bedingungen erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß in ein und derselben Eiektrophoresematrix eine Trennung unter Strukturstabilisierenden Bedingungen und anschließend unter strukturdestabilisierenden Bedingungen oder umgekehrt durchgeführt wird und eine Änderung der Elektrophoreserichtung der Biopolymeren zwischen den beiden Trennungen durch
    Umpolung der angelegten Spannung, durch Richtungsänderung der angelegten Spannung oder durch Umladung der Biopolymeron erfolgt.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisenden Biopolymere eine besonders niedrige oder eine besonders hohe Strukturstabilität besitzen oder der Polymerstrang kovalent zu einem Ring geschlossen ist.
    3. Verfahren nach den Ansprüchen 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß die zu trennenden Biopolymere Proteine sind.
    4. Verfahren nach den Ansprüchen 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß die zu trennenden Biopolymere Nukleinsäuren sind.
    5. Verfahren nach den Ansprüchen 1-2 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zu trennenden Nukleinsäuren Viroide oder Virusoide sind.
    6. Verfahren nach den Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß der Wechsel von stabilisierenden zu destabilisierenden Bedingungen oder umgekehrt durch Änderung der Temperatur erreicht wird.
    7. Verfahren nach den Ansprüchen 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß der Wechsel der Temperatur durch Einfüllen eines anders temperierten Elektrophoresepuffers erreicht wird.
    8. Verfahren nach den Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Biopolymere in einer Gelmatrix aufgetrennt werden, die aus Celluloseacetat, Acrylamid, Agαrose oder den Mischungen aus zwei oder mehreren dieser Substanzen oder aus mit diesen Materialien beschichteten Trägers ubstanzen bestehen kann.
    9. Verfahren nach den Ansprüchen 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion des auf Viroide oder Viru.oide zu untersuchenden Gewebes mit Hilfe von flüssigem Stickstoff oder flüssiger Luft und/oder mechanischer Homogenisation in Einmalartikeln durchgeführt wird.
    10. Verfahren nach den Ansprüchen 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Extraktion der Nukleinsäureπ keine gesundheitsschädlichen organischen Lösungsmittel Verwendet werden.
    类似技术:
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    EP0190267B1|1989-04-05|
    EP0190267A1|1986-08-13|
    AU4679885A|1986-02-25|
    DE3428385A1|1986-02-20|
    DD236398A5|1986-06-04|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1986-02-13| AK| Designated states|Designated state(s): AU JP SU US |
    1986-02-13| AL| Designated countries for regional patents|Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1986-04-05| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1985903978 Country of ref document: EP |
    1986-08-13| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1985903978 Country of ref document: EP |
    1989-04-05| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1985903978 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    DE19843428385|DE3428385A1|1984-08-01|1984-08-01|Elektrophoretisches verfahren zur trennung von biopolymeren|
    DEP3428385.4||1984-08-01||AT85903978T| AT42000T|1984-08-01|1985-07-25|Elektrophoretisches verfahren zur trennung von biopolymeren.|
    DE19853569295| DE3569295D1|1984-08-01|1985-07-25|Electrophoretic process for the separation of biopolymers|
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